Introduction
Materials and Methods
Test materials
Animal house
Experimental animals and administration
Clinical pathology
Anatomical pathology
Statistical analysis
Results and Discussion
Body weights and food consumption
Clinical pathology
Anatomical pathology
Conclusion
Introduction
간경변증(liver cirrhosis)은 전 세계적으로 널리 발생하고 있으며, 높은 이환율과 사망률의 주요 원인이다(GBD 2017 Cirrhosis Collaborators, 2020; Gines et al., 2021). 간경변증은 비만, 비알코올성 지방간염, 과도한 음주, B형 또는 C형 바이러스 간염, 자가면역 질환, 담즙정체성 질환, 철 또는 구리 과다 등 다양한 원인으로 인해 발생할 수 있다(Naveau et al., 2005; Hernandez-Gea and Friedman, 2011). 간경변증은 만성 염증 후에 발생하며 콜라겐과 같은 세포외 기질 단백질이 과도하게 축적되는 것이 특징이며, 이에 따라 정상 간 실질이 섬유성 조직 및 재생결절로 대체되어 간에 흉터 조직이 형성되고 간 부전을 초래하며, 간암까지 이행되기도 한다(Rojkind et al., 1979; Maher et al., 1988).
이러한 과정을 유도하기 위하여 여러 가지 간섬유화 실험동물 모델을 사용하고 있으나, in vivo 모델로는 흰쥐와 같은 실험동물에 에탄올, 사염화탄소, thiocetamide, dimethylnitrosamine (DMN), diethylnitrosamine 등의 화학물질을 활용한 유발 모델, 메티오닌 콜린 결핍 사료 또는 고지방 사료 등 사료 식이에 기반한 모델, 및 총담관 결찰술을 이용한 수술적 모델, 다제내성 관련 단백질 2 결핍 마우스나 Alms1Fat ausi 돌연변이 마우스를 활용한 유전자 변형 모델, 및 바이러스 또는 기생충을 활용한 감염 기반 모델이 있다(Crespo et al., 2016).
이러한 모델 중 DMN에 의한 간섬유화 유발 모델은 3주 동안 투여한 결과, 인간 질병과 유사한 간 섬유화를 일으키며, 투여된 쥐에서 쿠퍼 세포의 증가를 동반한 간 손상(George and Chandrakasan, 1996) 및 세포외 기질이 과도하게 증식되는 섬유화의 진행이 잘 관찰된다(Winwood and Arthur, 1993).
밀리타리스 동충하초(Cordyceps militaris L.)는 동충하초과의 버섯으로, 곤충이나 절지 동물에 기생하여 자라는 곤충 기생 곰팡이균이다(Jędrejko et al., 2021). 동충하초는 전통적으로 강장제로 사용하여 왔으며, 면역조절, 항산화, 항암, 항염, 항알러지, 항바이러스, 항균 및 항진균 작용을 나타내는 것으로 알려졌다(Das et al., 2010; Agrawal et al., 2017). 동충하초라는 이름으로 Cordyceps sinensis가 가장 많이 알려져 있으나, 자연채취가 힘들고 공급이 한정되어 있어 매우 고가이다. 반면에 최근 많이 연구되고 있는 Cordyceps militaris는 번데기 배지를 이용한 인공배양으로 대량생산이 가능하여(Olatunji et al., 2018), 새로운 건강 기능성 식품 및 한방 화장품 원료로 주목받고 있다(Jung and Kim, 2021).
따라서, 본연구에서는 유효물질 cordycepin을 다량 함유한 Cordyceps militaris 추출물 분말을 DMN으로 유도된 간섬유화된 SD계 흰쥐에 투여하여 간보호에 미치는 영향을 평가하고, 간기능 개선을 유도하는 근거를 찾기 위하여 in vivo 동물시험을 실시하였다. 이를 위해 간섬유화를 유발한 간손상 동물 모델에서 섬유화의 정도와 관련된 간 대식 세포를 관찰하여 Cordyceps militaris 추출물의 간기능 회복 능력에 대한 가능성을 연구하였다.
Materials and Methods
Test materials
Cordyceps militaris 추출물 분말(유효물질 Cordycepin 2.0% 이상 함유, COA, Sk bioland, Korea)은 ㈜알피바이오(Korea)로부터 제공받아 사용하였다. Cordyceps militaris 추출물 분말은 상온에서 보관하였으며, 측정된 Cordyceps militaris 추출물 분말은 멸균 증류수와 함께 magnetic stirrer로 교반하여 조제하였다.
간섬유화를 유발하기 위한 유도물질로 dimethylnitrosamine (DMN)를 Wako Co., Ltd. (147-03781, Japan)에서 구매하여, 멸균 생리 식염수에 10 mg·mL-1 용량으로 조제하였다. 간보호 효과를 비교하기 위하여 간기능 개선제로 잘 알려진 밀크씨슬의 유효성분인 silymarin을 양성대조물질로 사용하였다. Silymarin은 Sigma (S0292, USA)사에서 구매하여 사용하였다.
Animal house
순화기간 동안은 5마리 이하, 투여전 기간 및 투여기간에는 3마리 이하로 스테인레스 사육상자(255 [W] × 465 [L] × 200 [H] mm)에 수용하여 사육하였다. 실험동물실의 사육환경은 온도 23 ± 3℃, 상대습도 30 - 70%, 조명 12 h (12시간 간격 점등/소등), 환기횟수 10 - 20회·h-1, 조도 150 - 300 Lux로 유지하였다. 모든 기간 동안, 감마선이 조사된 고형사료(Lab Diet® #5053 PMI Nutrition International, USA)와 미세여과기 및 자외선 유수살균장치를 통과한 상수도수를 자유급여 하였다. 본 시험은 동물실험윤리 규정의 준수에 따라 안전성평가연구소 동물실험윤리위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인(승인번호: 1804-0158)을 거쳐 수행되었다.
Experimental animals and administration
5주령의 수컷 SD (Sprague-Dawley)계 흰쥐를 ㈜오리엔트 바이오(Korea)에서 공급받았다. 흰쥐는 SPF 동물실에 입수하여 5일간 순화하였다. 순화기간 후 건강한 동물을 체중을 근거로 Pristima System (version 7.3 Xybion Medical System Co., USA)을 이용하여 6개의 그룹, 부형제대조군, DMN 단독투여그룹(DMN), DMN과 각각 125, 250, 500 mg·kg-1 용량의 Cordyceps militaris 추출물 분말 투여군(DMN + CM125, DMN + CM250, DMN + CM500), 및 DMN과 Silymarin (DMN + Sil) 투여군으로 무작위로 배정하였다. 군 분리된 동물들은 7일간 투여 전 기간을 두었다. 투여기간에는 부형제 대조군을 제외한 모든 동물에 간독성 유도물질 DMN을 10 mg·kg-1 용량으로 일주일에 3회 복강내 투여하였다. 대조물질(부형제, 양성대조군 Silymarin)과 밀리타리스 동충하초 추출 분말은 21일동안 일 1회 경구 투여하였다.
Clinical pathology
모든 동물은 부검 당일 isoflurane으로 마취하고, 개복하여 후대정맥에서 혈액을 채취하였다. 채혈한 혈액은 약 0.5 mL의 혈액은 항응고제(EDTA-2K)가 담긴 채혈 튜브에 넣고, 혈액검사기(ADVIA2120i hematology analyzer, Siemens, Germany)를 이용하여 Total leukocyte count (WBC), Mean corpuscular hemoglobin (MCH), Total red blood cell count (RBC), Mean corpuscular hemoglobin concentration (MCHC), Hemoglobin (HGB), Platelet count (PLT), Hematocrit (HCT), Reticulocyte count (RET), Mean corpuscular volume (MCV), WBC differential count를 측정하였다. 약 1.0 mL의 혈액은 3.2% sodium citrate가 들어있는 채혈 튜브에 넣고, 원심분리(약 3,000 rpm, 10분, 실온)하여 혈장을 분리한 후, ACL 9000 coagulation analyzer (Beckman Coulture/Instrumentation Laboratory, Italy) 장비를 이용하여 혈액응고시간 검사(prothrombin time, PT; activated partial thromboplastin time, APTT)를 실시하였다. 약 4 mL의 혈액을 채혈하여 항응고제가 없는 튜브에 넣고, 실온에서 최소 90분 이상 방치시킨 후 원심분리(약 3,000 rpm, 10분, 상온)하여 혈청을 분리하여 혈액생화학분석기(Toshiba 200FR NEO chemistry analyzer, Toshiba, Japan)를 이용하여 glucose (GLU), alanine aminotransferase (ALT), blood urea nitrogen (BUN), total bilirubin (TBIL), creatinine (CREA), alkaline phosphatase (ALP), total protein (TP), creatine phosphokinase (CK), albumin (ALB), triglyceride (TG), albumin/globulin ratio (A/G), aspartate aminotransferase (AST), Total cholesterol (TCHO), Gamma glutamyl transpeptidase (GGT), high density lipoprotein cholesterol (HDL), low density lipoprotein cholesterol (LDL), lactate dehydrogenase (LDH), free fatty acid (FFA)를 측정하였다.
계획 도살되는 모든 동물을 대상으로 각각의 대사케이지를 이용하여 부검 전 약 16시간 동안 뇨를 수집하였다. 뇨는 뇨 분석기(Cobas U411 urine analyser, Roche, Germany)와 뇨 스틱(Combur 10 TM urine sticks, Roche, Germany)을 이용하여 Volume (VOL), nitrite (NIT), color (COL) / clarity (CLA), glucose (GLU), pH, erythrocyte (ERY), specific gravity (SG), ketone (KET), bilirubin (BIL), leukocytes (LEU), protein (PRO), urine sediments, urobilinogen (UBG) 항목을 검사하였다.
Anatomical pathology
모든 동물의 비정상 유무를 판단하기 위하여, 모든 장기를 육안 관찰하고, 뇌, 신장, 간에 대하여 중량을 측정하고 부검 시 측정한 체중에 대한 상대 장기 중량비를 계산하였다. 모든 동물의 신장과 간을 10% 중성 완충 포르말린에 고정하였다. 고정한 간, 신장 조직을 파라핀에 포매하고 박절하여 Hematoxylin (MA0101090MIRA01, StatLab, USA) / Eosin (3610MIRA01, StatLab, USA) (H&E) 시약으로 염색 후 현미경으로 관찰 평가하였다. 간은 anti-CD68 항체(ab125212, Abcam)를 사용하여 면역조직화학 염색을 실시하였으며 각각의 슬라이드 이미지에서 CD68 양성 Kupffer cell의 수를 평가하였다. 또한, Masson’s trichrome (VB-3016, VitroVivo biotech, USA) 염색으로 섬유화 정도를 평가하였다.
Statistical analysis
통계방법은 Statistical Analysis System (SAS/STAT version 9.4, SAS, USA) 또는 Pristima System (Version 7.3 Xybion Medical System Co., USA)을 이용하였다
군간 비교는 다중비교분석을 실시하였다. 데이터는 Bartlett’s test를 이용하여 등분산 검정을 실시한 후, 등분산된 데이터는 일원배치분산분석(ANOVA)으로 검정하고, 군간 차이는 Dunnett’s test로 분석하였다. 등분산되지 않은 데이터는 Kruskal-Wallis test로 분석하고, 투여군과 대조군 간의 차이는 Dunn’s rank sum test로 분석하였다.
Results and Discussion
Body weights and food consumption
투여 중 체중변화 및 사료 섭취량의 변화는 Table 1과 Table 2에 각각 나타내었다. 투여 15일부터 DMN 단독 투여군 및 DMN + CM250 및 DMN + CM500 투여군에서 체중감소가 관찰되었다. DMN + CM125 투여한 Cordyceps militaris 추출물 분말의 낮은 용량 투여군에서 유의한 체중변화 감소가 관찰되지 않았다(Table 1). 사료 섭취량 검사 결과, 모든 DMN 투여군에서 투여 8일부터 사료 섭취량의 감소가 유의미하게 관찰되었으나, DMN 단독 투여군과 Cordyceps militaris 추출물 분말 투여군 사이의 유의한 변화는 관찰되지 않았다(Table 2). 이전 연구에서도 DMN을 투여한 쥐에서 시기에 따른 체중 감소가 관찰되는 것으로 보고되었다(Chooi et al., 2016).
Table 1.
Summary of the body weight in this study.
| Groups | Acclimation period | Treatment period | TBW | ||||
| Day 1 | Day 6 | Day 1 | Day 8 | Day 15 | Day 22 | ||
| Mean ± SD | Mean ± SD | Mean ± SD | |||||
| Vehicle controlz | 144.80 ± 5.17 | 201.30 ± 6.01 | 267.20 ± 12.43 | 320.30 ± 22.77 | 360.80 ± 31.26 | 395.40 ± 36.63 | 361.80 ± 33.57 |
| DMNz | 140.50 ± 7.11 | 201.30 ± 5.99 | 268.40 ± 11.87 | 302.80 ± 15.67 | 315.40+D ± 18.87 | 338.90+D ± 23.87 | 298.80+D ± 24.74 |
| DMN + CM125z | 144.10 ± 3.07 | 201.20 ± 5.85 | 271.60 ± 10.72 | 309.50 ± 18.25 | 327.40 ± 34.70 | 359.90 ± 40.42 | 315.10+D ± 34.18 |
| DMN + CM250z | 144.50 ± 5.07 | 201.00 ± 6.71 | 271.00 ± 13.39 | 299.00 ± 27.24 | 313.20+D ± 44.66 | 340.20+D ± 50.91 | 297.80+D ± 45.74 |
| DMN + CM500z | 145.10 ± 4.88 | 201.60 ± 5.89 | 271.90 ± 10.77 | 296.40 ± 18.85 | 319.00*D ± 21.09 | 349.90*D ± 22.90 | 305.50+D ± 21.31 |
| DMN + Silz | 144.20 ± 4.93 | 201.20 ± 7.02 | 267.40 ± 10.43 | 311.90 ± 12.73 | 332.70 ± 19.92 | 360.40 ± 24.99 | 317.40*D ± 20.68 |
Table 2.
Summary of the food consumption in this study.
| Groups | Acclimation | Treatments | ||
| Day 8 | Day 8 | Day 15 | Day 22 | |
| Means ± SD | Means ± SD | Means ± SD | Means ± SD | |
| Vehicle controlz | 27.7 ± 1.1 | 30.8 ± 0.6 | 31.0 ± 0.5 | 31.0 ± 1.2 |
| DMNz | 28.2 ± 0.6 | 26.7+D ± 1.6 | 22.9*R ± 2.1 | 23.8+D ± 1.6 |
| DMN + CM125z | 28.8 ± 0.1 | 26.4+D ± 0.5 | 23.6*R ± 2.3 | 26.0+D ± 1.0 |
| DMN + CM250z | 28.3 ± 0.8 | 25.5+D ± 1.3 | 22.8+R ± 1.4 | 24.4+D ± 2.0 |
| DMN + CM500z | 29.7 ± 0.7 | 26.5+D ± 1.6 | 25.3 ± 0.7 | 27.2+D ± 2.0 |
| DMN + Silz | 28.6 ± 1.2 | 27.6+D ± 1.1 | 25.6 ± 0.3 | 26.7+D ± 0.6 |
Clinical pathology
혈액학적 검사 및 혈액생화학적 검사 결과는 Table 3과 Table 4에 나타내었다. DMN을 투여한 군에서 부형제 대조군과 비교하여 RBC, HGB, HCT, MCV, MCH 수치의 감소와 RET%, RETA 수치의 증가가 관찰되었다(Table 4). 이러한 혈액학적 지표들의 변화는 DMN에 의해 빈혈이 유발될 수 있음을 나타내고 있다(Usunobun et al., 2016). DMN 단독 투여군과 Cordyceps militaris 추출물 분말을 투여한 군 사이에 통계적으로 유의한 변화는 관찰되지 않았다(Table 3).
혈액 생화학적 검사 결과에서 DMN + CM125를 제외한 모든 DMN 투여군에서 ALT의 수치가 증가하였으며, DMN + CM250 및 DMN + CM500 투여군에서는 AST의 수치의 증가도 동반하였다(Table 4). ALT 및 AST 수치는 간손상의 지표로써 DMN + CM250 및 DMN + CM500 투여군에서 DMN 단독 투여군과 비교하여 더 높은 경향을 보이고 있으며, DMN + CM125 투여군에서는 DMN 단독 투여군과 비교하여 낮게 나타났다. 이러한 지표에서 DMN으로 유발한 간손상이 Cordyceps militaris 추출물 분말 250 mg·kg-1 이상 투여시에 오히려 간보호 효과보다 간손상을 가속할 수 있음을 나타내고 있으며, DMN으로 유발된 간손상에 대한 Cordyceps militaris 추출물 분말의 효능은 125 mg·kg-1 이하 농도에서 고려되야 하는 것으로 판단된다. 동충하초에 대한 간독성은 보고된 바 없으나, 선행 연구에 따르면 cordyceps sinensis의 3.0 g·kg-1 용량으로 랫드와 개에 3개월간 반복 경구 투여시 이상소견이 관찰되지 않았으나(Zhu et al., 1998), 누에 동충하초(Paecilomyces japonica)의 경우, 4주간 반복투여시 20 mg·kg-1 이상 투여군에서 신장의 병변이 관찰되었다(Kim et al., 2014). 또한 밀리타리스 동충하초 원재료 분말을 SD계 흰쥐에 4주간 반복 투여한 실험에서 3.0 g·kg-1 용량으로 투여한 수컷에서 특이적으로 신장독성이 관찰되었으며, 2.0 mg·kg-1 이상 투여한 암컷 및 수컷 투여군에서 ALT 및 AST 수치가 증가되어 나타났다(Zhou and Yao, 2013).
뇨생화학 검사 및 뇨침사 검사에서 모든 투여군 및 DMN 단독 투여군과 동충하초 추출물 분말을 투여한 군 사이에 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
Table 3.
Summary of the hematology and coagulation properties.
|
Para- meters | Units | V.C.z | DMNz | DMN + CM125z | DMN + CM250z | DMN + CM500z | DMN + Silz |
| Means ± SD | |||||||
| RBC | ×106·µL-1 | 8.2 ± 0.3 | 7.6*D ± 0.7 | 7.3+D ± 0.5 | 7.7 ± 0.5 | 7.6*D ± 0.4 | 7.6*D ± 0.4 |
| HGB | g·dL-1 | 16.0 ± 0.7 | 14.2+D ± 1.1 | 14.0+D ± 0.9 | 14.5+D ± 1.2 | 14.3+D ± 0.9 | 14.5+D ± 0.5 |
| HCT | % | 49.9 ± 2.3 | 44.0+D ± 3.4 | 43.1+D ± 2.4 | 44.9+D ± 3.7 | 44.6+D ± 2.8 | 44.9+D ± 1.6 |
| MCV | fL | 60.9 ± 1.5 | 58.4+D ± 1.6 | 59.1 ± 1.6 | 58.5*D ± 2.2 | 58.8*D ± 1.6 | 59.2 ± 1.8 |
| MCH | pg | 19.5 ± 0.5 | 18.9 ± 0.5 | 19.2 ± 0.4 | 18.9 ± 0.7 | 18.8 ± 0.6 | 19.1 ± 0.6 |
| MCHC | g·dL-1 | 32.0 ± 0.4 | 32.4 ± 0.4 | 32.5 ± 0.4 | 32.3 ± 0.3 | 32.1 ± 0.4 | 32.2 ± 0.5 |
| RET% | % | 2.7 ± 0.3 | 7.3+R ± 1.5 | 7.4+R ± 1.8 | 7.4+R ± 1.8 | 8.5+R ± 2.1 | 7.1+R ± 1.1 |
| RETA | ×109·L-1 | 220.0 ± 26.8 | 544.0+R ± 92.1 | 532.0+R ± 113.1 | 564.0+R ± 137.7 | 644.0+R ± 156.7 | 538.0+R ± 78.1 |
| PLT | ×103·µL-1 | 1,324.9 ± 170.3 | 1,401.6 ± 300.1 | 1,674.6 ± 319.7 | 1,395.1 ± 400.8 | 1,440.8 ± 476.2 | 1,784.1*D ± 255.5 |
| NEU% | % | 12.4 ± 2.7 | 10.7 ± 3.6 | 9.7 ± 2.9 | 6.7+D ± 2.3 | 7.9+D ± 2.0 | 9.6 ± 2.9 |
| LYM% | % | 83.0 ± 2.3 | 83.6 ± 3.4 | 84.0 ± 3.4 | 87.1*D ± 3.7 | 86.1 ± 3.0 | 84.6 ± 3.3 |
| EOS% | % | 0.9 ± 0.3 | 1.0 ± 0.4 | 1.3 ± 0.5 | 1.2 ± 0.5 | 1.5*D ± 0.5 | 1.6+D ± 0.5 |
| MON% | % | 2.5 ± 0.8 | 3.2 ± 0.7 | 3.8*R ± 0.9 | 3.7 ± 1.6 | 3.3 ± 1.0 | 2.9 ± 0.5 |
| BAS% | % | 0.6 ± 0.1 | 0.6 ± 0.1 | 0.5 ± 0.1 | 0.6 ± 0.1 | 0.5 ± 0.1 | 0.5 ± 0.1 |
| LUC% | % | 0.7 ± 0.2 | 1.0 ± 0.4 | 0.8 ± 0.2 | 0.8 ± 0.2 | 0.7 ± 0.2 | 0.7 ± 0.3 |
| WBC | ×103·µL-1 | 11.3 ± 3.9 | 13.6 ± 3.8 | 13.5 ± 1.6 | 15.2*R ± 4.0 | 13.7 ± 2.9 | 10.0 ± 1.6 |
| NEUA | ×103·µL-1 | 1.4 ± 0.6 | 1.5 ± 0.7 | 1.3 ± 0.3 | 1.1 ± 0.7 | 1.1 ± 0.3 | 1.0 ± 0.3 |
| LYMA | ×103·µL-1 | 9.4 ± 3.1 | 11.34 ± 3.2 | 11.3 ± 1.6 | 13.1*D ± 2.8 | 11.8 ± 2.7 | 8.5 ± 1.5 |
| MONA | ×103·µL-1 | 0.3 ± 0.2 | 0.4 ± 0.2 | 0.5+R ± 0.1 | 0.6*R ± 0.5 | 0.5 ± 0.2 | 0.3 ± 0.1 |
| EOSA | ×103·µL-1 | 0.1 ± 0.0 | 0.1 ± 0.1 | 0.2 ± 0.1 | 0.2*D ± 0.1 | 0.2+D ± 0.1 | 0.2 ± 0.1 |
| BASA | ×103·µL-1 | 0.1 ± 0.0 | 0.1 ± 0.0 | 0.1 ± 0.0 | 0.1 ± 0.0 | 0.1 ± 0.0 | 0.1 ± 0.0 |
| LUCA | ×103·µL-1 | 0.1 ± 0.0 | 0.1*D ± 0.0 | 0.1 ± 0.0 | 0.1*D ± 0.1 | 0.1 ± 0.0 | 0.1 ± 0.0 |
| PT | sec | 18.2 ± 2.8 | 15.1+R ± 1.1 | 15.2*R ± 1.0 | 16.8 ± 4.3 | 16.1 ± 1.9 | 16.3 ± 1.6 |
| APTT | sec | 18.9 ± 1.1 | 15.6+R ± 1.1 | 14.8+R ± 0.9 | 17.0*R ± 3.0 | 16.3*R ± 1.1 | 16.4*R ± 1.1 |
V.C., vehicle control; DMN, dimethylnitrosamine; CM, cordyceps militaris; Sil, silymarin; SD, standard deviation; RBC, red blood cells; HGB, hemoglobin; HCT, hematocrit; MCV, mean corpuscular volume; MCH, mean corpuscular hemoglobin; MCHC, mean corpuscular hemoglobin concentration; RET, reticulocyte count; RETA, absolute differential count of reticulocyte; PLT, platelet count; NEU, neutrophils; LYM, lymphocytes; EOS, eosinophils; MON, monocytes; BAS, basophils; LUC, large unstained cells; WBC, total leukocyte count; NEUA, absolute differential count of neutrophils; LYMA, absolute differential count of lymphocytes; MONA, absolute differential count of monocytes; EOSA, absolute differential count of eosinophils; BASA, absolute differential count of basophils; LUCA, absolute differential count of large unstained cells; PT, prothrombin time; APTT, activated partial thromboplastin time.
Table 4.
Summary of clinical chemistry.
|
Para- meters | Units | V.C.z | DMNz | DMN + CM125z | DMN + CM250z | DMN + CM500z | DMN + Silz |
| Means ± SD | |||||||
| GLU | mg·dL-1 | 112.0 ± 33.0 | 84.7 ± 18.1 | 95.2 ± 24.0 | 92.9 ± 30.9 | 87.1 ± 18.9 | 94.5 ± 12.7 |
| BUN | mg·dL-1 | 13.7 ± 1.6 | 11.5 ± 1.3 | 13.0 ± 1.9 | 12.7 ± 2.3 | 13.1 ± 2.0 | 12.0 ± 0.6 |
| CREA | mg·dL-1 | 0.5 ± 0.0 | 0.5 ± 0.0 | 0.5 ± 0.0 | 0.5 ± 0.0 | 0.5 ± 0.0 | 0.5 ± 0.0 |
| TP | g·dL-1 | 6.2 ± 0.3 | 6.0 ± 0.4 | 6.2 ± 0.3 | 6.0 ± 0.9 | 6.2 ± 0.6 | 6.2 ± 0.3 |
| ALB | g·dL-1 | 4.2 ± 0.2 | 4.0 ± 0.3 | 4.1 ± 0.2 | 4.0 ± 0.6 | 4.1 ± 0.4 | 4.1 ± 0.1 |
| A/G | Ratio | 2.0 ± 0.1 | 2.0 ± 0.1 | 2.0 ± 0.1 | 2.0 ± 0.1 | 2.0 ± 0.1 | 2.0 ± 0.1 |
| AST | IU·L-1 | 117.4 ± 16.4 | 144.2 ± 23.3 | 134.2 ± 29.3 | 169.1*R ± 72.9 | 161.1+R ± 33.1 | 130.8 ± 18.5 |
| ALT | IU·L-1 | 34.7 ± 5.7 | 52.7+R ± 11.4 | 45.2 ± 11.8 | 66.6+R ± 30.3 | 66.5+R ± 27.5 | 49.0*R ± 12.5 |
| TBIL | mg·dL-1 | 0.119 ± 0.0221 | 0.301+R ± 0.1289 | 0.223*R ± 0.0662 | 0.517+R ± 0.6968 | 0.317+R ± 0.1921 | 0.221*R ± 0.0481 |
| ALP | IU·L-1 | 620.6 ± 97.1 | 1,043.8*R ± 384.4 | 679.0 ± 107.4 | 1,410.3*R ± 1,261.0 | 875.0 ± 428.8 | 621.2 ± 142.8 |
| TCHO | mg·dL-1 | 59.5 ± 11.6 | 73.4 ± 14.3 | 78.1*R ± 10.8 | 80.6*R ± 25.6 | 72.0 ± 10.9 | 71.4 ± 14.5 |
| TG | mg·dL-1 | 25.4 ± 10.2 | 51.1+R ± 10.6 | 65.4+R ± 21.6 | 70.2+R ± 52.5 | 43.1 ± 10.0 | 33.1 ± 9.1 |
V.C., Vehicle Control; DMN, Dimethylnitrosamine; CM, Cordyceps militaris; Sil, Silymarin; SD, Standard deviation; GLU, glucose; BUN, blood urea nitrogen; CREA, creatinine; TP, total protein; ALB, albumin; A/G, albumin/globulin ratio; AST, aspartate aminotransferase; ALT, alanine aminotransferase; TBIL, total bilirubin; ALP, alkaline phosphatase; TCHO, total cholesterol; TG, triglyceride.
Anatomical pathology
뇌, 간, 신장의 장기중량 결과는 Table 5에 나타내었다. 부검 시 장기중량을 측정한 결과, DMN을 투여한 모든 투여군에서 간의 절대 중량이 감소하였으나, DMN 단독 투여군과 동충하초 추출물 분말을 투여한 군 사이에 유의한 변화는 관찰되지 않았다.
Table 5.
Summary of absolute and relative organ weighting.
| Groups | TBW (g) | Brain (g) | Kidney (g) | Liver (g) | |||
| Absolute | Relative to TBW | Absolute | Relative to TBW | Absolute | Relative to TBW | ||
| Means ± SD | Means ± SD | Means ± SD | Means ± SD | ||||
| Vehicle controlz | 361.8 ± 33.57 | 1.959 ± 0.1165 | 0.5437 ± 0.03621 | 3.106 ± 0.2583 | 0.8606 ± 0.05185 | 11.905 ± 1.8131 | 3.2860 ± 0.33807 |
| DMNz | 298.8+D ± 24.74 | 2.001 ± 0.1103 | 0.6726+R ± 0.04755 | 3.060 ± 0.3385 | 1.0243+R ± 0.07439 | 9.598 ± 1.3992 | 3.1989 ± 0.24953 |
| DMN + CM125z | 315.1+D ± 34.18 | 2.014 ± 0.1319 | 0.6470*R ± 0.08995 | 2.934 ± 0.3297 | 0.9402 ± 0.15038 | 10.499 ± 1.2580 | 3.3314 ± 0.15731 |
| DMN + CM250z | 297.8+D ± 45.74 | 1.950 ± 0.0833 | 0.6659+R ± 0.08176 | 2.781 ± 0.3987 | 0.9367 ± 0.04776 | 9.683 ± 3.2664 | 3.1880 ± 0.76453 |
| DMN + CM500z | 305.5+D ± 21.31 | 1.957 ± 0.0912 | 0.6423+R ± 0.03943 | 2.925 ± 0.3710 | 0.9561 ± 0.08441 | 9.319 ± 2.3941 | 3.0350 ± 0.69065 |
| DMN + Silz | 317.4*D ± 20.68 | 1.936 ± 0.0648 | 0.6121 ± 0.04300 | 3.141 ± 0.2814 | 0.9892+R ± 0.04695 | 10.324 ± 1.1074 | 3.2480 ± 0.19529 |
부검 시 육안적 관찰 결과는 Table 6에 나타내었다. DMN 투여한 모든 투여군의 간에서 변색 또는 국소 병소와 유착이 관찰되었으며, DMN 단독 투여군과 DMN + CM250 및 DMN + CM500투여군에서 간의 거친 표면이 관찰되었다. 이러한 변화는 조직학적 검사 결과, DMN 투여에 의한 간 섬유화와 관련된 것으로 보인다(Table 6). DMN 단독 투여군과 비교하여 DMN + CM125 투여군에서 육안적 소견이 현저하게 감소하였다.
Table 6.
Gross findings.
| Liver | Groups | |||||
| V.C.z | DMNz | DMN + CM125z | DMN + CM250z | DMN + CM500z | DMN + Silz | |
| Adhesion | 0 | 1 | 1 | 1 | 4 | 2 |
| Discoloration | 0 | 4 | 1 | 2 | 1 | 6 |
| Focus/foci | 0 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 |
| Rough surface | 0 | 2 | 0 | 1 | 1 | 0 |
간에서 DMN 투여에서 유도된 조직병리학적 변화로 간질성 섬유증, 담관 증식, 골수외 조혈 및 색소성 대식세포가 관찰되었으며, 이러한 변화는 DMN에 의해 섬유화된 간에서 잘 관찰되는 것으로 보고되고 있다(Chooi et al., 2016). 그러나, DMN 단독 투여군과 DMN + CM 투여군 사이의 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 1). 또한, DMN + Sil 투여군을 제외한 모든 DMN 투여군에서 간세포의 단일세포 괴사가 관찰되었다. Collagen fiber를 염색하기 위한 Masson’ trichrome 염색을 실시한 결과에서 간의 섬유화된 결합조직이 파란색으로 염색되었으며, 모든 DMN 투여군의 간에서 섬유화가 매우 약한(Grade 2) 정도에서 심한(Grade 4) 정도로 연결되어 관찰되었으며, DMN 단독 투여군과 DMN + CM 투여군 사이의 유의한 차이는 관찰되지 않았다(Fig. 2). 면역조직화학염색 상에서 간에 CD68 항체로 염색된 Kupffer cell의 수가 부형제 대조군에 비하여 모든 DMN 처리군에서 증가하였다(Fig. 3). DMN + CM500 투여군은 DMN 단독 처리군에 비해 CD68로 염색된 Kupffer cell의 수가 감소하는 경향을 보였으나, Kupffer cell의 수를 집계한 결과에서 통계적으로 유의한 차이는 없었다(Table 7). CD68은 간섬유화와 관련된 의미있는 지표로 섬유화된 간의 Kupffer cell에서 잘 발현되며(Saldarriaga et al., 2023), 섬유증이 완화된 쥐의 간에서 CD68 양성 Kupffer cell이 섬유화 조직과 비교하여 현저하게 적게 나타난다(Beljaars et al., 2014). 본 연구 결과에서는 조직학적 검사 결과에서 밀리타리스 동충하초 추출물 분말에 의한 간보호와 관련된 변화는 CD68의 감소 경향 외에 유의한 결과가 관찰되지 않았다.
Fig. 1.
Histopathology of liver by H&E (black scale bar = 200 µm). a: Vehicle control, b: DMN, c: DMN + CM125, d: DMN + CM250, e: DMN + CM500, f: DMN + Sil. Fibrotus connective tissue was increased in all DMN treated groups, however, there were no significant differences among CM treated groups. H&E, hematoxylin and eosin; DMN, dimethylnitrosamine; CM, cordyceps militaris; Sil, silymarin.
Fig. 2.
Histopathology of liver by Masson’s trichrome staining (black scale bar = 200 µm). a: Vehicle control, b: DMN, c: DMN + CM125, d: DMN + CM250, e: DMN + CM500, f: DMN + Sil. Fibrous connective tissue of extacellular matrix was stained blue by Masson’s trichrome staining. Fibrotic tissue was increased in all DMN treated groups, however, there were no significant differences among CM treated groups. DMN, dimethylnitrosamine; CM, cordyceps militaris; Sil, silymarin.
Fig. 3.
Immunohistochemistry of anti-CD68 (black scale bar = 200 µm). a: Vehicle control, b: DMN, c: DMN + CM125, d: DMN + CM250, e: DMN + CM500, f: DMN + Sil. Black arrows indicate Kupffer cell stained with anti-CD68 around fibrotic tissue. The number of Kupffer cells was decreased in DMN + CM250 and DMN + CM500 groups compared to DMN only treated group. CD68, cluster of differentiatino 68; DMN, dimethylnitrosamine; CM, cordyceps militaris; Sil, silymarin.
Table 7.
Number of CD68 positive Kupffer cell in slide image field.
Conclusion
본 연구는 DMN으로 유도된 간섬유화에 의한 간손상모델에서 Cordyceps militaris 추출물 분말의 간보호 효과를 평가하고자 수행하였다. DMN을 투여한 흰쥐에게 Cordyceps militaris 추출물 분말을 SD (Sprague-Dawley)계 흰쥐에게 0, 125, 250, 및 500 mg·kg-1의 용량으로 3주 동안 경구 투여한 결과, 혈액학, 임상화학, 장기 중량, 육안검사 및 현미경 검사에서 DMN 단독투여군과 Cordyceps militaris 추출물 분말 투여군 사이에는 유의한 차이가 없었으며, 간보호와 관련된 유의한 결과가 관찰되지 않았다. 오히려, DMN에 의한 간손상된 모델에 Cordyceps militaris 추출물 분말 250 mg·kg-1 이상을 투여한 군에서 ALT와 AST 같은 간손상 지표가 증가되어 관찰되었으며, 125 mg·kg-1을 투여한 군에서는 DMN을 투여한군에 비해 간손상 지표가 감소되어, 간손상 모델에서 독성이 가속화되는 용량에 대한 연구 또는 안전성 연구가 추가되어야 할 것으로 판단된다. 결론적으로, 본 연구에서는 Cordyceps militaris 추출물 분말을 투여한 SD계 흰쥐에서 디메틸니트로사민(DMN)으로 인한 간 손상의 간 보호 효과 평가에서 유의한 결과는 관찰되지 않았으며, 간보호 효능을 확인하기 위해서는 독성이 없는 더 낮은 농도에서 유효한 농도가 확인되어야 할 것으로 판단된다.
